इन-सॉल्यूशन सैंपल डाइजेस्टियन प्रोटोकॉल

आवश्यक अभिकर्मक

1 अमोनियम बाइकार्बोनेट (सिग्मा A6141) कार्यशील सांद्रता 50 mM
2 डाइथियोथ्रेइटोल (सिग्मा D5545) कार्यशील सांद्रता 100 mM
3 आयोडोएसिटामाइड (सिग्मा I1149) कार्यशील सांद्रता 200 mM
4 एमएस ग्रेड ट्रिप्सिन (सिग्मा T6567) कार्यशील सांद्रता 0.4μg /μl
5 फॉर्मिक एसिड (मर्क 5.33002.0050)

अभिकर्मक सेटअप (उपयोग से पहले ताजा तैयार करें)

  1. DTT समाधान: 50 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट में 100 mM DTT.

  2. आयोडोएसिटामाइड समाधान: 50 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट में 200 mM आयोडोएसिटामाइड समाधान.

  3. मिलीक्यू पानी में फॉर्मिक एसिड 1% (v/v).

  4. ट्रिप्सिन बफर: 50 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट में 0.4 μg /μl ट्रिप्सिन.

प्रोटीन नमूने के 100 μg के लिए ट्रिप्सिन पाचन प्रोटोकॉल

  1. प्रोटीन सैंपल में 100 mM DTT घोल के 5μl डालें।

  2. 30 मिनट के लिए 60° सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें

  3. प्रोटीन सैंपल में 200 mM आयोडोएसिटामाइड घोल के 5μl डालें।

  4. कमरे के तापमान पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।

  5. 1:25 (1μg ट्रिप्सिन से 25μg प्रोटीन) के अनुपात में ट्रिप्सिन बफर डालें।

  6. 37° पर इनक्यूबेट करें सेल्सियस पर रात भर हल्के से हिलाते हुए रखें।

  7. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, नमूनों में 1% फॉर्मिक एसिड (v/v) का 1 μl डालें।

  8. 37° सेल्सियस पर 20 मिनट तक इनक्यूबेट करें।

  9. नमूनों को उपयोग होने तक -20 डीप फ्रीजर में स्टोर करें।

संपर्क

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अंतिम बार अद्यतन किया गया: January 10, 2025
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