1 | अमोनियम बाइकार्बोनेट (सिग्मा A6141) | कार्यशील सांद्रता 50 mM |
2 | डाइथियोथ्रेइटोल (सिग्मा D5545) | कार्यशील सांद्रता 100 mM |
3 | आयोडोएसिटामाइड (सिग्मा I1149) | कार्यशील सांद्रता 200 mM |
4 | एमएस ग्रेड ट्रिप्सिन (सिग्मा T6567) | कार्यशील सांद्रता 0.4μg /μl |
5 | फॉर्मिक एसिड (मर्क 5.33002.0050) |
अभिकर्मक सेटअप (उपयोग से पहले ताजा तैयार करें)
DTT समाधान: 50 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट में 100 mM DTT.
आयोडोएसिटामाइड समाधान: 50 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट में 200 mM आयोडोएसिटामाइड समाधान.
मिलीक्यू पानी में फॉर्मिक एसिड 1% (v/v).
ट्रिप्सिन बफर: 50 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट में 0.4 μg /μl ट्रिप्सिन.
प्रोटीन नमूने के 100 μg के लिए ट्रिप्सिन पाचन प्रोटोकॉल
प्रोटीन सैंपल में 100 mM DTT घोल के 5μl डालें।
30 मिनट के लिए 60° सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें
प्रोटीन सैंपल में 200 mM आयोडोएसिटामाइड घोल के 5μl डालें।
कमरे के तापमान पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
1:25 (1μg ट्रिप्सिन से 25μg प्रोटीन) के अनुपात में ट्रिप्सिन बफर डालें।
37° पर इनक्यूबेट करें सेल्सियस पर रात भर हल्के से हिलाते हुए रखें।
प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, नमूनों में 1% फॉर्मिक एसिड (v/v) का 1 μl डालें।
37° सेल्सियस पर 20 मिनट तक इनक्यूबेट करें।
नमूनों को उपयोग होने तक -20 डीप फ्रीजर में स्टोर करें।